農(nóng)桿菌EHA103菌種RealTime PCR技術(shù)服務：

一、熒光定量PCR化學原理介紹　　

實時熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，*后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

二、農(nóng)桿菌EHA103菌種主要實驗步驟

1、設(shè)計并合成Realtime PCR引物。

2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG（SYBR® Green）的PCR反應的優(yōu)化。

3、 樣品RNA抽提   實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。

實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA

4、RNA質(zhì)量檢測

a. 農(nóng)桿菌EHA103菌種紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度

b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。

5、使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進行反應，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

6、 制備標準曲線樣品：進行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增，其產(chǎn)物進行梯度稀釋用于做標準曲線。

7、標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應液中（其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司），進行RealTime PCR擴增和檢測。

8、 農(nóng)桿菌EHA103菌種檢測結(jié)果進行標準曲線分析：以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。

9、提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表。

三、農(nóng)桿菌EHA103菌種樣本準備

組織或細胞標本