植物組織中丙二醛含量的測定

植物組織中丙二醛含量的測定

實驗原理

丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代***酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的**川（3,5,5-**基惡唑2,4-二酮），其*大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中*主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的*大吸收波長在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDA—TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100～300μg/g DW，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3＋的終濃度為0.5μmol/L。

A. 直線回歸法

MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm波長下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖（0～25mmol/L）與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后，測定上述三個波長的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為：

Y532＝﹣0.00198＋0.088D450 ①

B．雙組分分光光度計法

據(jù)朗伯-比爾定律：D＝kCL，當(dāng)液層厚度為1cm時，k=D/C，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時，某一波長下的消光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的消光度之和。

已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40，7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0，532nm波長下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式：

C1(mmol/L)=11.71D450 ②

C2(μmol/L)=6.45(D532－D600)－0.56D450 ③

式中 C1－為可溶性糖的濃度；

C2－為MDA的濃度；

D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。

實驗試劑

10%三***（TCA）；0.6%硫代***酸，先加少量的氫氧化鈉（1mol/L）溶解，再用10％的三***定容；石英砂。

實驗設(shè)備

紫外可見分光光度計1臺；離心機1臺；電子天平1臺；10ml離心管4支；研缽兩套；試管4支；刻度吸管：10ml 1支，2ml 1支；剪刀1把。

實驗材料

受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官

實驗步驟

1. 實驗材料受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。

2. MDA的提取稱取剪碎的試材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml TCA進一步研磨，勻漿離心（4000×g）10min，上清液為樣品提取液。

3. 顯色反應(yīng)和測定吸取離心的上清液2ml（對照加2ml蒸餾水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。

4. 計算含量

(1) 直線方程法按公式①求出樣品中糖分在532nm處的消光度值Y532，用實測532nm的消光度值減去600nm非特異吸收的消光度值再減去Y532，其差值為測定樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的消光度值。按MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算求出提取液中MDA濃度。

(2) 雙組分分光光度法按公式③可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。

用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計算測定樣品中MDA的含量：
MDA（μmol/g FW）＝ (MDA濃度(umol/L)*提取液體積(ml))) / 植物組織鮮重(g)