改進(jìn)的間接酶聯(lián)**法檢測(cè)磺胺類**
實(shí)驗(yàn)原理
62.5mgTS，34.5mgN-羥基琥珀酰亞胺酯和45.3mg 1,3-二環(huán)己基碳二亞胺在1.5ml的干燥的N,N-二甲基酰胺中反應(yīng)18h， 4oC，通過濾過作用移除生成的二環(huán)乙基脲沉淀物，得到濾液。濾液被加到含有65mgLPH 2ml的PBS中，用NaOH調(diào)節(jié)PH到7.6。這個(gè)混合液在4oC，攪拌24h。通過TLC檢測(cè)磺胺藥有沒有聚合現(xiàn)象。因?yàn)榈蛪A性自由的氨基磺酸簇（例如，磺胺噻唑pka是2.36），尤其賴氨酸的氨基簇(pka10.28)?？赡苁敲恳环N氨基酸形成酰胺的主要原因。24h后，這個(gè)反應(yīng)混合物被轉(zhuǎn)移到透析液里，透析對(duì)抗1L 8M尿素12h，透析液被移到4L，50mM的碳酸氫氨中，接著移到4L，25mM的碳酸氫氨，每一種透析液至少8h。透析袋中的內(nèi)容物被凍干。TS-bsa使用相同的方法，bsa代替LPH。
實(shí)驗(yàn)試劑
無(wú)水硫酸鈉；150ml甲醇；100ml鹽酸； 2.1g 2-氨基-4-噻唑乙酸；
2.65g N-Acetylsulfanilyl chloride (ASC)；50ml吡啶；100ml二氯甲烷層；
5g硅膠；50g二氧化硅柱(50*2.4)；200ml 1:4的甲醇-氯仿洗脫
50ml 2MNAOH溶液；100ml 6N的鹽酸。
實(shí)驗(yàn)材料
50 ml的圓底燒瓶
250 ml三頸燒瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
2-氨基-4-噻唑-乙酸甲酯的合成：
1. 在冰浴中，將無(wú)水硫酸鈉干燥的甲醇100ml，加到一個(gè)250ml的三頸燒瓶。
2. 將鹽酸氣體加到裝有甲醇的燒瓶中，不停攪拌，產(chǎn)生大量氣泡。當(dāng)溶液的質(zhì)量增加大約60g，停止加鹽酸。
3. 將2.1g的2-氨基-4-噻唑乙酸緩慢的加到燒瓶里，除去冰浴，攪拌10分鐘。
4. 燒瓶中的溶液進(jìn)行回流6小時(shí)，此時(shí)為輕微的黃色溶液。
5. 將溶液移入一個(gè)快速蒸發(fā)儀中，加入25ml干燥的甲醇，移除溶劑。
6. 從乙酸乙酯和甲醇中再結(jié)晶出來的固體為合成的固體(熔點(diǎn)為169-171o C)，即2-氨基--噻唑乙酸甲酯，淺黃色。
N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羥基)甲基]-2-噻唑}-磺胺的合成：
1. 將2.65gN-Acetylsulfanilyl chloride(ASC)加到一個(gè)50ml的圓底燒瓶中，在攪拌下，加入5ml干燥的吡啶。
2. 將1.50g的2-氨基-4-噻唑乙酸乙酯緩慢的加入到吡啶溶液中，維持溫度在不超過40 oC。溶液為褐色的，進(jìn)行回流，1.5h，冷卻到室溫。
3. 緩慢攪拌下，加入30ml溫水，用二氯甲烷(3*25)萃取。
4. 二氯甲烷層用硫酸鈉干燥，濾過，同時(shí)大部分溶劑用快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀移除。加入大約5g硅膠，移除剩余的溶劑，留下一些淡黃色的粉末。這些粉末經(jīng)過一個(gè)50g的二氧化硅柱(50*2.4)，這個(gè)柱子用150ml 1:4的甲醇-氯仿洗脫，.移除這些溶劑，得到N4-乙?；?N1-{4-[(甲氧羥基)甲基]-2-噻唑}-磺胺(1.6g，50%產(chǎn)量)。
N-[ 4- Carboxymethy1) -2-thiazolyl]sulfanilamide(TS)的合成：
25ml，2MNAOH溶液加到提純的0.95g N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羥基)甲基]-2-噻唑}-磺胺中，回流2h，冷卻至室溫后，用6N的鹽酸調(diào)節(jié)PH到4.0。得到的渾濁的溶液用乙酸乙結(jié)合物測(cè)定抗原決定簇密度和自由芳香族氨基的存在。
1. 抗體準(zhǔn)備
1) 四只10周齡雌性兔子，一只兔子被注射0.8ml無(wú)菌的PBS和FCA(1:1)的油狀混合物；兩只兔子被注射TS-結(jié)合LPH的混合液；另外一只兔子用ts-bsa做**原。老鼠被注射0.5mg的混合液(2*0.2ml)肩胛骨，0.8ml油狀混合物臀肌部(2*0.4ml)。兔子接受同樣的載體注射，不同的是FIA代替FCA，在**次注射后間隔2到4周。
2) 在4周后，從兔子耳源大靜脈取血，大約每只老鼠15毫升，6周時(shí)，通過心臟采血每只兔子大約70毫升，收集的血液室溫放置1.5小時(shí)，離心血清，1000轉(zhuǎn)，5分鐘，出現(xiàn)清亮的黃色的血清和紅色的血細(xì)胞沉積，血清被收集到1.5ml的密封的容器，保存到-20oC。
2. 從兔子血清中分離IgG
0.6ml蛋白A填充物被裝到10ml的一次性聚丙烯柱中，這個(gè)柱子用含0.02%疊蛋化鈉的10mlPBS沖洗。已經(jīng)被濾過的血清0.5ml慢慢從蛋白A柱子的上端緩緩加入，大約停留15分。需15ml含疊氮化合物的PBS去洗脫除IgG的血清蛋白類，大約3分鐘。1ml血清蛋白類被收集。接下來，用大約5ml乙酸洗脫IgG。洗脫液被轉(zhuǎn)移到透析袋中 (4L，25mM的碳酸氫銨24h，每4h換液)。這個(gè)透析袋中的物質(zhì)被冷凍干燥，儲(chǔ)存在-20oC。從0.5ml兔子血清可重獲 IgG約為2mg。
3. **球蛋白Fab片段的產(chǎn)生
1) 固定用的木瓜蛋白酶0.5ml被加到一個(gè)玻璃檢測(cè)管中。消化緩沖液(2.76g磷酸二氫鈉、3.80g乙二胺四乙酸鹽粉防己堿鹽和 3.51 g半胱氨酸氫氧化物，1M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH到7.0)被加到檢測(cè)管中，木瓜蛋白酶可以經(jīng)緩沖液酶被分離，重復(fù)用消化緩沖液洗脫酶一次。固定用的木瓜酶被懸浮在0.5ml的消化液中。凍干的IgG(4mg)溶解在2ml新鮮的消化液中，加入到經(jīng)木瓜酶預(yù)處理過的檢測(cè)管里。在37 oC搖動(dòng)水浴中溫育酶-IgG混合物5h。5h后，1.5ml 10 mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液ph7.5，被加到IgG酶消化液中，F(xiàn)ab片段被分離。
2) Fab片段，不水解的IgG和Fc片段被裝到蛋白A填充物的頂部，洗脫柱用10mlPBS，在速度為1 mL/3 min，第1mL被丟棄，接下來的3 mL被收集轉(zhuǎn)移到透析袋中。用4L，25mM的碳酸氫銨24h，每4h換液。這個(gè)透析袋中的物質(zhì)被冷凍干燥，從0.5mL兔子血清中重獲1.1 mgFab(通過凝膠等電點(diǎn)聚焦電泳確認(rèn)Fab是否被純化)。
4. 間接ELISA，96孔微量滴定
1) 加入200μL含的20μg/mL(TS-OV，NS-OV，CS-OV)的0.01%的硫柳汞PBS，，4oC包被過夜，在每個(gè)板上放一塊濕袋。**天，倒掉包被液，每個(gè)孔加入200μL含的1%BSA的硫柳汞的PBS，再放到相同的袋子里，室溫1h。倒掉包被液，洗3次板，加入100 μ含0-25μg/mL磺胺藥的硫柳汞的PBS。
2) 稀釋血清至0.05%BSA的板被保存在塑料袋中，室溫2h，用硫柳汞PBS洗三次。加入稀釋3000倍的山羊抗兔子抗體，加入硫柳汞PBS至每孔200μL/well，包括空白組也被保存在塑料袋中，室溫2h，用硫柳汞PBS洗三次。
3) 酶作用底物，0.4 mg/mL(o-phe- nylenediamine)和過氧化銨(1.0mg/mL)，0.1M檸檬酸鹽，PH4.75加到每個(gè)孔里，200μL/well，在反應(yīng)30min后，室溫條件下，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收率，450nm測(cè)定吸收值。
