如何正確的進行ELISA測定操作

臨床ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現(xiàn)分述如下。

一、臨床標(biāo)本的收集和保存

用于ELISA測定的臨床標(biāo)本*為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前臨床上使用血清標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、**、特種蛋白、細胞因子和****等。對用于**和****測定的血清標(biāo)本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現(xiàn)：生長**、促黃體**（LH）和促卵泡**（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類**時，有必要在密切相連的時間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如****的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的*適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

（1）要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。

（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免**污染，一則**的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些**的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

（3）血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應(yīng)在-70℃以下。

（4）冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。

（5）標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)**污染所致的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。

二、試劑準(zhǔn)備

在臨床實驗室，對試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備*為關(guān)鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時配制。

三、加血清樣本及反應(yīng)試劑

在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是**的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

四、溫育

溫育是ELISA測定中影響測定成敗*為關(guān)鍵的一個因素。ELISA作為一種固相**測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。*為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。

溫育這一步是臨床ELISA測定中*容易出現(xiàn)問題的步驟。通常目前國內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時間為37℃ 30分鐘～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較完全的結(jié)合，低于1小時，可能會影響測定下限。因此，關(guān)于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：

要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時間。一般來說，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那么一個多月的時間，在做HBsAg測定的室內(nèi)質(zhì)控中，測定由衛(wèi)生部臨床檢驗中心供應(yīng)的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內(nèi)溫度才能達到37℃，從而適當(dāng)延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應(yīng)溶液中測量觀察即可。