蛋白質(zhì)**沉淀步驟

**沉淀
材料
1，  蛋白A 或蛋白G
2，  一抗
3，  **沉淀緩沖液：20 mM 磷酸鈉, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脫氧膽酸鈉 and 0.02% 疊氮化鈉.
（> NOTE: 50 mM 醋酸鈉緩沖液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%疊氮化鈉 也可作為**沉淀的緩沖液，能提高蛋白G的結(jié)合功效）
4，  洗脫液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5
5，  SDS-PAGE 上樣緩沖液 (pH 6.8)： 2% SDS, 62.5 mM Tris 堿, 10% 甘油, 2-5% 2-羥基乙硫醇,
步驟：
1，  用50 μl**沉淀緩沖液溶解抗原，向溶液中加入1倍過量的特異性一抗。加入**沉淀緩沖液至樣品體積為0.2 ml。一般情況下，在此體積下2-5μg的純化抗體能夠較好地形成抗原抗體復(fù)合物。
2，  樣品4°C.孵育過夜。
3，  將適量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗體復(fù)合物中(~ 50 μl of gel per 5 μg of antibody)。
4，  室溫下，輕柔混勻樣品，孵育2小時。
用0.5ml**沉淀緩沖液洗蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物，離心2-3分鐘，棄上清。重復(fù)此步驟至少6次。
5，  用50 μl洗脫液孵育蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物5分鐘，將抗原抗體復(fù)合物從蛋白A或蛋白G上洗脫下來，離心，收集上清。另用50 μl洗脫液孵育膠5分鐘，離心，收上清。將兩個上清混合。
6，  立即調(diào)節(jié)蛋白樣品的pH至生理值，用一種合適的、多次離心的緩沖液調(diào)節(jié)，如1.0 M Tris, pH 7.5 (10 μl of this buffer to 100 μl of the supernatant should be sufficient).
7，  將洗脫成分除鹽。
8，  準(zhǔn)備好樣品待定性。

NOTE：如果用SDS-PAGE定性蛋白質(zhì)，省去步驟6-9。在完成第5步之前，用0.5ml蒸餾水洗膠。離心蛋白A或蛋白G 2-3分鐘，棄上清。用25μl SDS-PAGE上樣緩沖液在95°C孵育蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物5分鐘。樣品離心，收集上清。重復(fù)一次，匯集上清至總體積50μl。由此樣品則準(zhǔn)備妥當(dāng)。